La proteina supresora de tumores Retinoblastoma caracterizacion de su dominio AB y mecanismo de interaccion con la oncoproteina E7 del papilomavirus humano = The Retinoblastoma tumor suppressor protein: caracterization of its AB domain and mechanism of interaction with the human papillomavirus E7 oncoprotein
La proteina supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una proteina "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en celulas eucariotas, y su inactivacion funcional se encuentra asociada a la progresion del cancer en humanos. En particular, la interaccion de la...
| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis |
| Idioma: | Castellano |
| Publicado: |
Buenos Aires, Argentina :
Universidad de Buenos Aires
2010.
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| Ver en Biblioteca Universitat Ramon Llull: | https://discovery.url.edu/permalink/34CSUC_URL/1im36ta/alma991009853958006719 |
| Sumario: | La proteina supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una proteina "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en celulas eucariotas, y su inactivacion funcional se encuentra asociada a la progresion del cancer en humanos. En particular, la interaccion de la proteina HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncogenico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-funcion de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la produccion recombinante y el estudio en solucion de esta proteina o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en solucion del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta proteina incluyendo la interaccion con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresion recombinante que permitio obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95 por ciento. Estudios biofisicos revelaron que RbAB se encuentra en solucion como un monomero plegado a 20 C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiologica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en solucion. Estos estudios representan el primer analisis sobre las propiedades conformacionales en solucion de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un analisis termodinamico y cinetico de la interaccion entre RbAB y HPV16-E7 en solucion. Estos estudios revelaron que el 90 por ciento de la energia de interaccion es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interaccion con el dominio RbAB, indicando que la misma es de caracter modular. El caracter intrinsecamente desordenado de E7 modula la interaccion, y la fosforilacion de la region CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cineticos revelaron que la union del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociacion rapida y un tiempo de vida en el orden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrostatico, que podrian determinar al menos en parte la especificidad de la interaccion de las diferentes proteinas E7 de papilomavirus. El estudio mecanistico de las interacciones proteina-proteina es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interaccion presentes en las celulas, y la presente tesis aporta informacion sobre una de estas interacciones, tomando como proteina modelo a una proteina clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas proteinas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el analisis de los mecanismos que permiten la discriminacion de diversas proteinas que compitan por la union al "surco LxCxE". The retinoblastoma tumor suppressor protein (Rb) is a hub protein wich plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. In particular, the oncogenicity of high-risk human papillomavirus (HPV) depends critically on the interaction of one of its proteins, HPV-E7, with Rb. The delay in the understanding of structure-function relationships for Rb is due, to a large extent, to the difficulty in obtaining large quantities of pure protein which is amenable to biophysical analyses. In the present thesis, we studied the biophysical and interaction properties of the human RbAB domain, which mediates many of Rb's functions, amongst them the interaction with E7. We developed a protocol for its recombinant expression which allowed us to obtain up to 6 mg/liter of recombinant protein with ]95 por ciento purity. Biophysical studies showed that RbAB is a folded monomer at 20 C, but that it has marginal stability at the mammalian body temperature (37 C). Folding studies strongly suggest that the A and B domains have different thermodynamic stability. This work represents the first study of conformational properties of the RbAB domain in solution. In the second part of this thesis, we performed thermodynamic and kinetic analysis of the interaction between HPV-E7 and RbAB. These studies showed that 90 por ciento of the binding free energy is provided by the high affinity LxCxE linear motif, but that multiple regions in E7 additionally participate of the interaction, pointing to its modular nature. The intrinsically disordered nature of E7 modulates binding, and phosphorylation at a conserved CKII-PEST site potentiates binding affinity. Kinetic studies revealed that the LxCxE motif binds through a two-state route with a fast association, which is favoured by electrostatic interactions, and a complex lifetime of 20-200s. The electrostatic nature of the interaction may explain at least in part the binding specificity of different papillomavirus E7 proteins. The mechanistic study of protein-protein interactions is essential to the understanding of the complex cellular protein interaction networks, and the present thesis provides biophysical information on one of these interactions, using the E7-Rb interaction as a model system. Given that the LxCxE motif is conserved throughout viral and cellular Rb partners, the information provided by this work may set the grounds for analyzing the mechanisms of discrimination of multiple possible targets which bind the "LxCxE cleft". |
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